Esta técnica es utilizada como la prueba "estándar de oro" para diagnosticar COVID-19 en humanos, la PCR amplifica fragmentos del ADN copiándolos numerosas veces a través de una serie de reacciones químicas. La cantidad de ciclos necesarios para amplificar las secuencias de ADN de interés para que sean detectables por la máquina de PCR, es conocido como umbral de ciclo (Ct), es lo que los investigadores y profesionales médicos observan para detectar el virus.
Sin embargo, no todos los laboratorios obtienen los mismos valores Ct, en ocasiones a veces también llamados valores “Cq”. En un esfuerzo por hacer que los resultados sean más comparables entre laboratorios que realizan esta técnica, el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) de EEUU, contribuyó a un estudio multiorganizacional que analizó el anclaje de estos valores de Ct a una muestra de referencia con cantidades conocidas del virus.
El SARS-CoV-2 es un virus de ARN y su material genético es monocatenario en lugar de bicatenario como el ADN y contiene algunos componentes moleculares diferentes, a saber, y recordando las clases de biología en el colegio la base nitrogenada de uracilo está presente en el ARN en lugar de timina que está en el ADN. Pero la prueba de PCR sólo funciona con ADN, y los laboratorios primero deben convertir el ARN en ADN para detectar COVID-19. Para la prueba, el ARN se aísla de la muestra de un paciente y se combina con otros ingredientes, incluidas secuencias cortas de ADN conocidas como cebadores, para transformar el ARN en ADN.
Al realizar una prueba de PCR, los laboratorios a menudo usan el valor de Ct para hacer un diagnóstico positivo o negativo de COVID-19. Los laboratorios a menudo establecen un valor Ct de "corte" por encima del cual interpretan y pueden declarar a un paciente "negativo" si el virus no se detecta después de una cierta cantidad de ciclos. Pero a pesar de que diferentes laboratorios pueden detectar el virus con precisión utilizando sus pruebas de PCR, utilizan sus propios métodos e instrumentos de prueba, lo que podría conducir a diferentes valores de Ct.
Puede pensar en ello como hornear galleta en el mismo horno, con la misma receta, las galletas que hornea durante 10 minutos probablemente serán más suaves que las galletas horneadas durante 15 minutos, pero si algo en la receta fuera diferente, si el horno no tenía la misma temperatura, si usó un tipo diferente de bandeja para hornear, por ejemplo, entonces podría no ser tan comparable.
Entonces, para este estudio, un equipo de investigación de varias organizaciones se dispuso a explorar cuánto podrían variar los valores de Ct entre diferentes laboratorios cuando realizaron pruebas de PCR en las mismas muestras de referencia que contenían cantidades conocidas del virus SARS-CoV-2. Un grupo de organizaciones e instituciones dirigidas por INSTAND, una sociedad científica interdisciplinaria de Alemania que promueve la garantía de calidad en los laboratorios médicos, desarrolló dos materiales de referencia con concentraciones cuidadosamente medidas del ARN del SARS-CoV-2. El Material de Referencia MR-1 tenía una carga viral estimada de 10 millones de copias por mililitro y el Material de Referencia MR-2 que tenía una carga viral estimada de un millón de copias por mililitro.
Para garantizar que estos valores fueran precisos, tres Institutos Nacionales de Metrología, el Laboratorio Nacional de Medición de Química y Biomedición (LGC) del Reino Unido, Physikalisch-Technische Bundesanstalt (PTB, en Alemania) y NIST de EEUU, midieron y validaron los materiales de referencia mediante PCR digital. La PCR digital sigue los mismos pasos que la PCR tradicional, pero es una versión más avanzada. En la PCR digital, la muestra se divide en miles de pequeñas gotas, también se agrega un compuesto para que, cuando se detecta el ADN objetivo, emita un brillo, lo que permite a los investigadores confirmar si la muestra es positiva para el coronavirus con la presencia de moléculas fluorescentes.
Los Materiales de Referencia se enviaron a un total de 305 laboratorios en Alemania, lo que produjo 1109 conjuntos de datos para ser analizados. Los valores de Ct diferían entre laboratorios según el sistema de prueba o el equipo de PCR utilizado y las secuencias de ADN objetivo del virus. Por ejemplo, los ensayos de PCR destinados a detectar un gen clave (el gen "N") en el virus COVID-19 tenían un rango de valores de Ct entre 17,6 y 26,9 para MR-1, mientras que para MR-2 el rango estaba entre 20,7 y 30,1. Los rangos entre los dos MR se superponen (20,7 a 26,9) a pesar de que tienen diferentes concentraciones de carga viral, lo que demuestra que no es posible determinar la concentración precisa solo a partir de los valores de Ct.
Las diferencias en los valores de Ct entre laboratorios mostraron la utilidad de los Materiales de Referencia como herramienta para ayudar a los laboratorios a comparar y estandarizar sus resultados. El valor Ct puede ser una forma de medir la carga viral, la cantidad de virus en el cuerpo de una persona, pero la variación en los valores de Ct entre laboratorios subraya que las dos variables simplemente están correlacionadas entre sí. Por ejemplo, si un individuo tiene una carga viral más alta, entonces su valor de Ct sería bajo porque se necesitarían menos ciclos para amplificar el material genético del virus. Pero el valor de Ct puede variar según el material de extracción o el método utilizado, todas estas cosas pueden afectar en qué punto se detecta el ADN.
Sin embargo, al usar los Materiales de Referencia apropiados, los valores de Ct pueden convertirse potencialmente en un valor real de concentración de virus en copias por microlitro, lo que sería una forma de cuantificar la carga viral, aunque este no fue el enfoque del estudio. Aunque los valores de Ct por sí solos no determinan qué tan enfermo o infectado está un individuo, comprender estos valores podría ayudar a informar las decisiones sobre el establecimiento de criterios para monitorear a las personas afectadas por el coronavirus. Y los Materiales de Referencia de ARN pueden ayudar a que estos resultados sean más confiables y comparables.
Los laboratorios biometrológicos deben usar Materiales de Referencia bien caracterizados junto con sus métodos de prueba en lugar de confiar solo en los valores de Ct. Por sí solos, los valores de Ct no son fácilmente comparables entre laboratorios de pruebas, pero es beneficioso que los investigadores tengan acceso a Materiales de Referencia y comprendan su importancia.
Referencia: https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0262656
